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domingo, 13 de mayo de 2007

Criopreservacion de Pronucleos: Rol en el Programa de Fertilizacion Asistida

REV CHIL OBSTET GINECOL 2003; 68(4): 287-292
Instituto de Investigaciones Materno Infantil (IDIMI), Servicio y Departamento de Ginecología y Obstetricia, Hospital Clínico San Borja-Arriarán, Universidad de Chile.

Los procesos vitales requieren cambios bioquímicos que se llevan a cabo a través del movimiento de moléculas en un medio acuoso. Si el agua, dentro del citoplasma de una célula viva es convertida en hielo a temperatura suficientemente bajas, se detiene el movimiento molecular, la vida de la célula queda detenida en ese momento, con la incorporación de los criopreservantes biológicos y sistemas computacionales que manejan el descenso de la temperatura, no hay formación de cristales de agua en un momento que puedan romper la célula.

Dentro de la criobiología humana, existe la posibilidad de criopreservar espermios, oocitos, pronúcleos (PN), embriones desde 2 células a blastocistos, tejido ovárico y testicular.

Pareciera lógico criopreservar espermios y oocitos separados. Los espermios no pierden su potencial, pero hay problemas marcados asociados a la congelación de oocitos que no han podido ser resueltos y que se traducen en una variable y reducida opción de fertilizar, clivar y dar un nacido vivo.

La opción de criopreservar oocitos en estado de PN en nuestro centro, se genera de un criterio biológico y ético, en el primero, se sabe que entre las 17 y 22 horas postinseminación, el oocito está en fase G2 del primer ciclo celular, antes de la disolución de los pronúcleos que son visibles a la microscopia convencional, esto ocasiona la opción de un mínimo daño celular ; en el segundo criterio, el comité de ética del hospital, consideró adecuado congelar en estado de preembrión, el cual es el oocito en estado de pronúcleo.

Se incorpora la técnica en diciembre de 2001, la criopreservación de pronúcleos con los objetivos de:
· Disminuir al número de embriones a transferir al útero
· Disminuir el número de embarazos múltiples.
· Postergar el momento de la transferencia embrionaria cuando no son óptimas las condiciones de endometrio o cuando existe riesgo materno elevado de desarrollar un Síndrome de hiperestimulación ovárica severa.
· Tener la posibilidad de intentos posteriores de transferencias embrionarias, sin tener que hiperestimular nuevamente a la paciente. Lo que implica una segunda oportunidad con menor costo económico y de estrés afectivo que un ciclo de hiperestimulación ovárica implica..

Las técnicas de reproducción asistida, siendo tecnológicamente sofisticadas y de un costo elevado, sobre todo por los fármacos requeridos para la hiperestimulación ovárica logran un embarazo entre el 30-40% de los casos .

Esto representa que un 60-70% de las parejas no se embaraza al primer intento y por tanto buscará repetir el procedimiento.

Por otra parte, el número de oocitos fertilizados no siempre permite predecir el número de Pro núcleos aptos y por tanto se tiende a fertilizar mayor número de oocitos. Una vez generados los Pro núcleos, cuando no existe la posibilidad de criopreservación, se transfieren todos los que clivaron a embrión, porque no se hace descarte de Pro núcleos.

Tener la opción de criopreservar estos Pro núcleos permite bajar el número de PN por transferencia, reservando el resto para una transferencia posterior.

La criopreservación, se realiza mediante la aplicación de criopreservantes para proporcionar al PRONUCLEO protección frente a los efectos de la temperatura, durante los procesos de congelación y descongelación. El método usado para la criopreservación es el congelamiento lento, con el uso combinado de crioprotectores (1.5 M 1,2 propanadiol) y no penetrantes (0.1 M sacarosa). Para lo anterior se utiliza un programa computacional y un congelador (CRYOMED®) que lleva la temperatura ambiente a -160° C, temperatura del Nitrógeno líquido en donde son almacenados (Figura 1). Cada Pronucleo está en una cajuela claramente identificada.

Figura 1. Proceso de criopreservación y almacenaje de PN.

Descongelamiento de Pro núcleo: Se descongelan mediante un protocolo que permite regresar de -196° C a la temperatura ambiental en forma gradual, con un crioprotector externo (sacarosa) manteniendo el gradiente osmótico extracelular que previene la entrada de agua excesiva durante el retiro del crioprotector. Cuando el crioprotector ha salido completamente, el embrión se coloca en el medio de cultivo para que inicie su proceso de desarrollo.

Transferencia de pronúcleos criopreservados: Utilizamos la modalidad de ciclo medicado, dando dosis ascendentes de valerinato de estradiol oral, a partir del primer día del ciclo menstrual, con el objetivo de desarrollar un endometrio trilaminar con un espesor de 8 mm. El monitoreo ultrasonográfico, determina la ausencia de reclutamiento folicular y confirma el desarrollo endometrial para dar inicio a la administración de progesterona en dosis de 100 mg/24 horas vía intramuscular, desde 4 días antes de la transferencia. El laboratorio de Fertilizacion Asistida, descongela los PN dos días antes de la transferencia, de tal forma de transferir un embrión con 6 a 8 blastómeras.

A todas las pacientes con función ovárica, se les administra un análogo de GnRh (3,75 mg depot IM), en el día 20-22 de ciclo anterior, de tal forma que no exista reclutamiento folicular en el ciclo medicado para la transferencia (Figura 2). La transferencia al útero se realiza mediante un catéter ultra soft (CCD®, France), bajo visión ecográfica transabdominal. A los 12 días post transferencia, se realiza la determinación sanguínea de bHCG para confirmar embarazo bioquímico o no, y una ecografía en la semana 6 para determinar los embarazos clínicos. El soporte de estradiol y progesterona se mantiene hasta la semana 12 de gestación en el caso de embarazo.




Figura 2. Esquema de preparación endometrial.
http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0717-75262003000400003&lng=pt&nrm=i